Intracitoplazmatsko Injiciranje Spermija: Osvrt na Tehniku i Njenu Uspješnost

Uvod
Više od dvadeset godina pratimo ubrzani razvoj tehnika medicinski pomognute oplodnje.

Izvantjelesna oplodnja (engl. in vitro fertilization – IVF) je metoda liječenja neplodnosti uzrokovane tubarnim čimbenikom, endometriozom, u blažih oblika neplodnosti uzrokovanih muškim čimbenikom, te kod neplodnosti nepoznatog uzroka. Provodi se tako da se spolne stanice stavljaju u izravni kontakt u in vitro uvjetima.

Sredinom 80-ih godina 20. stoljeća počinju se razvijati eksperimentalni modeli novih metoda mikromanipulacije na svim stadijima gameta i preimplantacijskih zametaka, kako u dijagnostičke, tako i u terapeutske svrhe, što tehnički omogućava mikromanipulator – uređaj koji manualne pokrete prevodi u fine pomake radnih mikropipeta. Zona pelucida je membrana glikoproteinske strukture koja okružuje jajnu stanicu i preimplantacijski zametak.

Odgovorna je za indukciju akrosomske reakcije, vezanje vrsno-specifičnih spermija, blokiranje polispermije, mehanički štiti oocitu i priječi prodor biokemijskih toksikanata. S obzirom na to da je zona pelucida barijera penetraciji spermija, razvili su se postupci koji omogućuju što bliži kontakt gameta: djelomično razaranje zone pelucide (engl. partial zona dissection – PZD) i inseminacija spermija u perivitelini prostor (engl. subzonal insemination – SUZI). Nasuprot očekivanog, navedenim tehnikama nisu postignuti zadovoljavajući rezultati. Stupanj fertilizacije je nizak uz visoku stopu polispermije.




DALJNJA LITERATURA:




 
merchant r et al
In vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection for male infertility
saznaj više

 
bridges p et al
Methodology matters: IVF versus ICSI and embryonic gene expression saznaj više

 
lu y et al

Different sperm sources and parameters can influence intracytoplasmic sperm...
saznaj više

 
oliveira jb et al

Pregnancy outcomes in women with repeated implantation failures ...
saznaj više


Uvođenjem tehnike intracitoplazmatske mikroinjekcije spermija došlo je do značajnog pomaka u razvoju medicinski pomognute oplodnje. Kod težih oblika muške neplodnosti sa smanjenim brojem (manje od 500 000 spermija po ml ejakulata), smanjenom pokretljivošću, neodgovarajućom morfologijom spermija, zatim kod neopstruktivne azoospermije s održanom spermatogenezom, opstruktivne azoospermije, te retrogradne ejakulacije, primjenjuje se metoda izravnog unošenja spermija/spermatida u citoplazmu jajne stanice (engl. intracytoplasmic sperm injection – ICSI).

Nadalje, primjenjuje se i u slučaju kada je fertilizacija reducirana ili izostaje nakon inseminacije oocita u in vitro uvjetima, zatim nakon kriopohrane spermija, nakon kriopohrane oocita, te nakon preimplantacijske genetske dijagnostike oocita (prvog polarnog tjelešca) za monogenske bolesti.

Neki autori zastupaju mišljenje da bi se ICSI metoda trebala primjenjivati kod svih parova uključenih u postupak izvantjelesne oplodnje. Priprema sjemena za postupak ICSI ovisi o kvaliteti i vrsti uzorka. Najčešći oblik pripreme sjemena je metodom isplivavanja (“swim up”) ili pomoću gradijenta gustoće. Na navedene načine može se pripremiti sjeme dobiveno postupkom masturbacije, punkcijom i aspiracijom epididimisa (engl. microsurgical epididymal sperm aspiration – MESA), te u slučaju retrogradne ejakulacije.

Izolacija spermija i spermatida iz tkiva testisa (engl. testicular sperm extraction –TESE; testicular sperm aspiration – TESA) složen je postupak koji zahtijeva dobiveno tkivo testisa prvotno macerirati kemijskim i/ili mehaničkim putem, višestruko ispirati i pregledavati dobiveni materijal, te izolirati spermije/ elongirane spermatide za postupak ICSI.


Nove metode odabira spermija
Neposredno prije postupka ICSI, suspenzija spermija stavlja se u odgovarajuću otopinu medija povećane viskoznosti s ciljem usporavanja pokretljivosti. Odabir spermija još uvijek je daleko od zadovoljavajućeg jer se odabir zasniva na morfološkoj prosudbi (engl. morphologically selected sperm injection – IMSI). Odabrani spermij samo na osnovi zadovoljavajuće morfologije može sadržavati fragmentiranu DNA ili kromosomske nepravilnosti. Rezultati studija pokazali su da oblik spermija ne može predvidjeti prisustvo numeričkih kromosomskih aberacija.

Značajno mjesto u maturaciji spermija ima expresija gena HspA2 (engl. heat shock protein A2). Razina navedenog proteina povezana je sa stupnjem stanične zrelosti spermija, integritetom DNA, zrelošću kromatina, učestalošću kromosomske aneuploidije i funkcijom spermija uključujući fertilizacijski potencijal. Tijekom dozrijevanja spermija, preoblikovanje plazma membrane uključuje i formiranje veznih mjesta za zonu pelucidu i receptora za hijaluronsku kiselinu.

Metoda selekcije spermija pomoću hijaluronske kiseline je nova tehnika. Učestalost spermija s kromosomskom disomijom je smanjena za četiri do pet puta u spermija odabranih pomoću hijaluronske kiseline. Nadalje, isključeni su nezreli spermiji s ekstruzijom citoplazme, perzistentnim histonima i lomovima DNA lanca.

Druga metoda odabira spermija zasniva se na morfologiji organela pokretnih spermija (engl. motile sperm organellar morphology examination MSOME). Tehnika koristi svjetlosni mikroskop s Nomarski optikom pojačanom digitalnom tehnologijom koja omogućava povećanje od 6300x. Prikaz podataka Bartoova i sur. te Berkovitza i sur. ukazuju da je stopa fertilizacije i trudnoće značajno veća pri odabiru spermija po kriterijima MSOME. Autori iznose podatak da je uspješnost postupka MSOME 60% naspram IMSI 25%, dok je stopa spontanih pobačaja nakon MSOME 14% u usporedbi s onom u IMSI koja iznosi 40%.


Primjena lasera u postupku ICSI

Smatra se da je degeneracija oocita nakon postupka ICSI u rasponu od 5% do 19%. Razlog degeneracije nije jasan. Analizom zone pelucide pokazano je da nema fragmentacije zone pelucide tijekom postupka. Otvor se zatvara neposredno nakon što se ICSI igla makne, dok se injekcijsko mjesto nakon 15 min više ne može detektirati.

Prisutna je i mogućnost oštećenja oocite zbog mehaničke kompresije. Oocite nisu jednako osjetljive na postupak ICSI; tako se pokazalo da su osjetljivije one s fragilnom oolemom koja lagano puca pri samom postupku mikroinjekcije.

Mogućnost da se neposredno prije postupka ICSI načini otvor na zoni (engl. driling zone pellucide) laserom omogućuje manipulaciju ICSI mikropipete manje traumatski po oocitu. Kanal u zoni promjera 5-6 μm napravi se pomoću 3 do 5 pulsa niske energije (1,48 μm valne duljine) pri trajanju pulsa manje od 2 mikro sekunde. Rienzi i sur. prvi su izvijestili o trudnoći koja je uslijedila nakon laserom pomognutog postupka ICSI u bračnog para koji je prethodno imao četiri ICSI postupka sa slabim preživljenjem oocita. Autori su izvijestili o minimalnoj deformaciji oocita i preživljenju 8 od 13 oocita.

Druge skupine autora također su izvijestile o značajnom smanjenju degeneracije oocita u bolesnica s fragilnom oolemom, kao i bolju kvalitetu zametaka. Međutim, podatci koje su iznijeli Richter i sur. na osnovi opsežne studije dovode do zaključka da laserom pomognuti postupak ICSI nema utjecaja u ukupnoj populaciji ICSI bolesnica, kao ni u onih s fragilnom oolemom.


ICSI postupak pomoću polarizacijskog mikroskopa

Diobeno vreteno tijekom mejoze ima važnu ulogu u segregaciji kromosoma. Pokazano je da se nepravilnosti strukture diobenog vretena povećavaju s dobi bolesnica. Položaj diobenog vretena u metafazi II u oocitama određuje se u odnosu na položaj polarnog tjelešca. Da bi se izbjeglo oštećenje diobenog vretena prilikom ulaska ICSI mikroigle u oocitu, oocita se fiksira tako da je polarno tjelešce na položaju 6 sati. Međutim, pokazano je da se na osnovi položaja polarnog tijela ne može sa sigurnošću predvidjeti položaj diobenog vretena.

Korak dalje u postupku ICSI postignut je primjenom svjetlosnog polarizacijskog mikroskopa (Polscope) koji omogućava neinvazivan prikaz diobenog vretena. Moon i sur. uspoređivali su oocite u ovisnosti je li diobeno vreteno vidljivo i pokazali su da je značajno veći postotak kvalitetnih zametaka nakon postupka ICSI oocita s vidljivim diobenim vretenom. Autori su zaključili da se analizom oocita Poloskopom može predvidjeti razvojni potencijal zametaka. Međutim relativni položaj diobenog vretena unutar oocita ne pokazuje utjecaj na razvojni potencijal zametaka.




3D Animation - ICSI




Neonatalni i opstetrički podatci o trudnoćama nakon ICSI postupka
Bonduelle i sur. iznijeli su u opsežnoj studiji podatke o trudnoćama nakon postupka ICSI. Prije iznošenja podataka potrebno je navesti da su autori definirali sljedeće: gestacijsku dob računali su tako da je aspiracija oocita na 14. dan ciklusa; biokemijsku trudnoću kao značajan porast HCG (>10 IU/l) između 10. i 20. dana nakon porasta LH; spontani pobačaj kao gubitak fetusa do 20 tjedana trudnoće; mrtvorođenče kao intrauterinu smrt ili rođenje djeteta u gestacijskoj dobi višoj od 20 tjedana ili težinu djeteta veću od 500g; prijevremeni porod kao porod prije napunjenog 37. tjedna trudnoće.

Od ukupnog broja ICSI trudnoća (3 073) biokemijskih trudnoća bilo je 8,2% (251), izvanmateričnih 1,6% (49), spontanih pobačaja 13,9% (428), prekida trudnoće 0,6% (18), te je 2 254 djece rođeno. Studijom nije obuhvaćeno 2,4% (73) trudnoća jer se bolesnice nisu javile u centar.

Iz podataka proizlazi da približno 75% trudnoća završava i porodom.

Prekidi trudnoće su učinjeni u devet slučajeva nakon prenatalne kariotipizacije, jedna nakon prenatalne DNA dijagnostike i osam nakon ultrazvučne dijagnostike. Nepravilan fetalni kariotip nađen je u 42 slučaja od 1 437 prenatalno ispitanih ICSI fetusa (2,9%), od čega su 23 nepravilnosti de novo (devet je nepravilnosti spolnih kromosoma, 14 nepravilnosti autosoma, kako numeričke, tako i strukturne), dok je u 19 slučajeva uočena nasljedna nepravilnost i to u njih 15 naslijeđena od oca.

Srednja gestacijska dob iznosila je 37,9 (+/-2,6) tjedana trudnoće. Srednja porođajna težina djece bila je 2 807 g, duljina 47,9 cm, opseg glave 33,4 cm. Mala porođajna težina (<2 500 g) prisutna je u 26,7% slučajeva. Perinatalna smrt u 1,87%.

Veće malformacije prisutne su u 3,38% rođene djece (srčana greška 1%, nepce 0,21%, mišićno/skeletni sustav 0,8%, živčani sustav 0,42%, mokraćni sustav 0,24%, spolni sustav 0,38%, gastrointestinalni 0,1%, uho i oko 0,03%, metabolički 0,07%).

Min i sur. iznose da su zabilježena ukupno 644 pozitivna testa na trudnoću od ukupno 2 600 započetih ciklusa (24,8%). U 509 bolesnica bila je prisutna pozitivna srčana akcija (19,6%), a poroda je bilo 448 (17,0%). Autori zaključuju da bi kao mjerilo uspješnosti postupka trebalo uzimati broj poroda jednog djeteta u terminu po broju ciklusa koji su započeti. U svojoj studiji iznose da je po ovom kriteriju njihova uspješnost 11,1%.

Horak i sur. svojom su studijom pokazali da strukturne razlike između spermija dobivenih u postupku MESA i spermija iz ejakulata nemaju značajan utjecaj na ishod ICSI postupka. Nadalje, Schwarzer i sur. iznose da se postotak vraćanja zametaka, postotak trudnoća i poroda po ICSI ciklusu ne razlikuje između postupka sa spermijima dobivenim prilikom TESE i spermija dobivenim postupkom MESA.

Retrospektivna studija Pasqualotto i sur. donosi podatke da je pravilna i nepravilna fertilizacija nakon ICSI postupka uzrokovana opstruktivnom azoospermijom 60,5% i 16,6% dok u slučaju neopstruktivne azoospermije iznosi 54% i 16,4%. Postotak trudnoća po bolesnici i postotak spontanih pobačaja iznosi 39,8% i 28% u skupini bolesnica s opstruktivnom azoospermijom, dok u skupini neopstruktivne azoospermije iznosi 28,3% i 40%.

Uspoređujući postupak PESE (engl. percutaneous epididymal sperm aspiration) i TESA, postotak pravilne i nepravilne fertilizacije iznosi 58,7% i 21,4% vs. 57;3% i 14,5%. Postotak trudnoća po bolesnici i spontanih pobačaja za postupak PESE iznosi 54,5% i 11,1%, odnosno za postupak TESE 31% i 41%. Autori navode da pokretni spermiji dobiveni iz epididimisa ili testisa rezultiraju manjim postotkom spontanih pobačaja u usporedbi s nepokretnim spermijima.

Zanimljivo je istraživanje skupine Dozortsev i sur. koji iznose podatke da je postotak fertilizacije veći u skupini PESA bolesnika, ali je postotak implantacija značajno bolji u TESA skupini bolesnika uz tendenciju većeg postotka trudnoća koje se razvijaju i manji postotak spontanih pobačaja u slučajevima opstruktivne azoospermije.

Filicori i sur. ističu problem prijevremenog poroda u žena nakon postupka izvantjelesne oplodnje. Uz veću incidenciju višeplodnih trudnoća koje utječu na prijevremeni porod, uključeni su i drugi čimbenici. Autori smatraju da prijevremeni porodi mogu biti povezani s anamnezom neplodnih bolesnica. Pokazalo se da, ukoliko je samo muški čimbenik neplodnosti prisutan, nije zamijećena veća incidencija prijevremenih poroda.

Allen i sur. smatraju da trudnoće nakon hormonske stimulacije gonadotropinima imaju veći rizik za perinatalne komplikacije. Ovaj rizik pojačava kako uzrok neplodnosti, tako i višeplodne trudnoće, te bračni par treba biti obaviješten o povećanom riziku opstetričkih intervencija kao što je induciranje poroda i porod carskim rezom. S obzirom na to da se radi o neplodnom bračnom paru koji je ostvario trudnoću, nije zanemariv ni psihološki čimbenik.



DALJNJA LITERATURA:




 
alucal j et al
Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) – What are the risks?

saznaj više

 
patrat c et al
Optimal Timing for Oocyte Denudation and Intracytoplasmic Sperm Injection saznaj više

 
luna m et al

Should ICSI be recommended routinely in patients with four or fewer oocytes retrieved?
saznaj više

 
al-fifi  s et al

Congenital anomalies and other perinatal outcomes in ICSI ...
saznaj više


Praćenje razvoja djece začete postupkom ICSI

Belva i sur. pokazali su kroz psihološka i neurološka ispitivanja djece začete postupkom ICSI i spontano rođene djece, da nema značajne razlike između ove dvije skupine djece u predpubertetnom i pubertetnom razdoblju. Što se tiče intelektualnih funkcija, ICSI djeca pokazuju nešto više rezultate u, kako ukupnoj, tako i verbalnoj inteligenciji.

U pogledu motoričkog razvoja, ono je podjednako kod djece začete postupkom ICSI i spontano rođene djece u dobi do osam godina. Nadalje, nakon detaljnih oftalmoloških istraživanja u djece začete postupkom ICSI pokazano je da nema nikakve razlike u pogledu vizualne funkcije i okularne morfologije u odnosu na spontano rođenu djecu.

Međutim kongenitalne malformacije su značajno više zastupljene u djece rođene nakon ICSI postupka, ali većina malformacija je ispravljena manjim kirurškim zahvatima.

Pretpostavka da je jedna trećina muške neplodnosti uzrokovana genskom etiologijom izaziva
zabrinutost ulaska bolesnika s azoospermijom i oligoasthenozoospermijom u postupak medicinski pomognute oplodnje, a to je većina bolesnika uključenih u postupak ICSI.

Kongenitalna neplodnost može biti uzrokovana mutacijom gena, kvantitativnim i strukturalnim nepravilnostima spolnih kromosoma i autosoma. Vjerojatnost nasljeđivanja CFTR gena u postupku ICSI u sljedeću generaciju je 50%, za Klinefelterov sindrom mozaika kariotipa i do 70%, dok je prijenos AZF mutacije na djecu muškog spola 100%46. Stoga se parovima uključenim u postupak zbog muškog čimbenika neplodnosti preporučuju genetsko savjetovanje zbog rizika od de novo kromosomskih nepravilnosti (posebice spolnih kromosoma), uz prenatalno praćenje zbog kongenitalnih strukturnih nepravilnosti, uključujući biokemijski i ultrazvučni probir, te prenatalnu dijagnostiku, kao što je CVS
ili amniocenteza. U obzir treba također uzeti i mogućnosti koje pruža preimplantacijska dijagnostika.


::dr. sc. Sanja Vujisić Živković :: Laboratorij za humanu reprodukciju, Klinika za ginekologiju i porodništvo, Opća Bolnica "Sveti Duh", Sveti Duh 64, 10000 Zagreb :: sanja_vujisic@hotmail.com ::






izvorni članak

Medicina


  Literatura:

1. Edwards RG, Brody SA. Principles and practice of assisted human reproduction. London: W.B. Saunders Company, 1995.

2. Thadani VM. Injection of sperm heads into immature rat oocytes. J Exp Zool 979;210:161-8.

3. Keefer CL. Fertilization by sperm injection in the rabbit. Gamete Res 1989;22:59-69.

4. Goto K. Bovine microfertilization and embryo transfer. Mol Reprod Devel 1993;36:288-90.

5. Cohen J, Malter M, Fehilly C, Wright G, Elsner C, Kort H, Massey J. Implantation of embryos after partial opening of oocyte zona pellucida to facilitate sperm penetration. Lancet 1988;2:162.




:: važne pravne informacije ::

HDGO portal pruža stručne informacije o brojnim temama i događanjima u ginekologiji, opstetriciji i humanoj reprodukciji. Svrha navedenih informacija nije davanje medicinskih savjeta ili uputa o uporabi pojedinih proizvoda niti promocija pojedinih proizvoda kao takvih. Niti jedan posjetitelj web portala ne smije koristiti informacije sadržane na ovom portalu za dijagnosticiranje ili liječenje zdravstvenog problema ili bolesti bez savjetovanja sa stručnim medicinskim osobljem jer su informacije objavljene na portalu predviđene kao dodatak, a ne kao zamjena za stručnost, vještinu, znanje, iskustvo i procjenu specijaliste za ginekologiju i opstetriciju koji se brine o bolesnici, odnosno trudnici.

HDGO je poduzeo i ubuduće će poduzimati odgovarajuće napore kako bi informacije sadržane na ovom web portalu bile točne i precizne, ali istovremeno ne daje nikakva jamstva glede njihove potpunosti. Shodno tome, takve informacije ne mogu služiti kao predložak za sudsko medicinska vještačenja. Takve informacije HDGO priopćuje svojim članovima na redovitim okupljanjima i putem stručnih smjernica odobrenih od strane nadležnih tijela.

Stručne smjernice HDGO donose se prema strogim stručnim pravilima i specifičnim uvjetima ginekološke i opstetričke struke u RH, te se nakon odobrenja od strane nadležnih tijela objavljuju s posebnom napomenom.

Save